文献解读文献早期乳腺癌患者微小

SensitiveDetectionofMinimalResidualDiseaseinPatientsTreatedforEarly-StageBreastCancer

ClinCancerRes.Jun1;26(11)

本研究来自：

DepartmentofMedicalOncology,Dana-FarberCancerInstitute,Boston,Massachusetts.Parsonsetal

研究背景

意义：全球每年有超过60万人死于乳腺癌，主要原因是患者发生转移复发的风险较高。系统性复发是由于患者初诊时出现了微转移，而这种微转移无法通过影像学和常规血液筛查检测到。辅助全身治疗可显著降低癌症复发的风险，但目前的检测技术在确定哪些患者需要辅助系统治疗和实时评估哪些治疗方案达到预期效果方面还不完善；高灵敏的检测微转移性疾病的方法可以使高风险患者从治疗中获益更多，同时避免其他患者因过度治疗而产生潜在的不良影响；

液体活检可以通过追踪血液中循环DNA（circulatingcell-freeDNA，cfDNA）中的肿瘤突变来检测乳腺癌的微小残留（minimalresidualdisease，MRD），由于出现明显转移性疾病之前的时间相对较短，需要更灵敏更大的动态监测范围的检测技术，以便更快地识别MRD患者，使患者在后续治疗中获益；

个体化MRD检测：病人的肿瘤相关突变都是独一无二，无论是大量的数字液滴PCR（ddPCR）分析，还是大panel进行深度测序，都是为了实现广泛的患者覆盖范围，即使如此，也只能覆盖每个患者有限数量的突变。因此，需要个体化检测来追踪大多数患者的许多肿瘤突变，进而提高临床灵敏度、特异性，降低错误检出率。

研究方法-主要研究队列

Patients：ERt/HER2metastaticbreastcancer(MBC)，确诊6个月内，采集10-20cc外周血及肿瘤组织；

患者入组条件：

06-protocol：纳入99名35岁乳腺癌患者；

05-protocol：血浆组织样本可配对的所有乳腺癌患者；

Allpatients均接受了辅助治疗（局部或全身），平均随访时间7.1年。

研究方法-检测技术

?基因组当量基线：genomicequivalent(GE)limit；

血液中ctDNA的比例低于样本中每个基因拷贝数的两倍时，现有追踪一个或几个突变的监测技术无法检测到MRD，即为基因组当量（GE）极限；利用GE量化患者的tumorfraction。

?检测技术：个性化定制

?研究步骤：

WES对活检组织进行测序，选定SNVs；

对患者进行多节点采血，检测MRD，任一节点呈MRD-positive，该患者即为MRD阳性；

对经过治疗的患者进行检测，并长时间随访，以监测患者出现转移复发的风险比。

研究方法-技术路线

技术路线：

?10-20cc血浆中提取cfDNA；

?建库：cfDNA投入量5-20ng（gDNA投入量20ng），采用duplexUMIadapters（IDT构建）；

?杂交（HS）：患者个性化定制探针进行杂交捕获；

?突变Fingerprint（突变指纹谱）：利用HapMap正常gDNA（NA）对肿瘤gDNA（NA）进行梯度稀释，重复样本中，肿瘤gDNA中为杂合子或纯合子，而正常gDNA为纯合子的高置信度突变位点纳入突变指纹集合中，得到个SNVs及97个SNVs的panel，其中97panel为panel的子集，并利用这两个panel来确定该技术的检测性能，特别是tumorfraction的准确性和检测限；在TCGA数据库中乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤和胰腺癌的高频出现的SNV，扩充SNV集合；

?Panel的设计：对患者进行全外显子组测序和体细胞突变检测：

SNV的clonality，以及临床相关性；

利用过滤器去除低GC区域及参考基因组中特异性差的SNV；

患者特异性panel：合成探针均围绕着过滤后的SNV位点±bp进行设计。

?突变Calling：

正反向reads均覆盖的突变；

Reads中有5个以上非参考碱基，或有2个以上非参考碱基但不包含N碱基；

突变碱基质量≥89；

突变碱基的mapping质量≥60；

突变位点与片段顶端距离≥13bases；

?MRDcalling：≥2突变检出为MRD阳性；

研究结果

结果1:高灵敏度的ctDNA检测方法

低于GElimit中可检测到MRD：追踪的突变越多，越能高灵敏度的检出比GElimit低倍的MRD-positive。

可检测到MRD的limit：

Tumorfraction为1/k时，panel的中位检出能力为82%，MRD-positive占85%（17/20）；

检测到的tumorfraction预期与检测值的一致性：r2=0.94；

健康人样本中，该检测技术有较高的特异性。

结果2:高灵敏度的ctDNA检测法对转移性乳腺癌的MRD检测

激素受体阳性转移性乳腺癌（MBC）的MRD检测：临床转移复发之前，该检测法对患者MRD的检测限为1/10k。

16例HR+MBC患者，共收集35份血浆样本（采集时间为诊断后6个月内采集活检组织及外周血）；

利用活检组织样本确定患者的突变指纹谱（mutationfingerprints）：SNV中位数=51.5个SNV（rang：6-）；

MRD-positive：81%的患者（13/16）；86%的cfDNA样本（30/35）；

治疗前患者的Tumorfraction最高，治疗受益患者中tumorfraction水平低于未收益患者；

治疗受益患者中，5例假阴性样本的检出限中位值（0.）比12例MRD-positive样本检出限中位值（0.）高出3倍；

结果3:高灵敏度ctDNA检测法对经过新辅助/辅助治疗后MRD的检测

?目的：确定高灵敏度ctDNA检测法对MRD检测的预测能力和早期乳腺癌患者复发的提前预警期；

?例0-III期乳腺癌样本：HR+/HER2-（86例，61%）、HR+/HER2+（25例，18%）、TNBC（31例，22%）；

治疗方案：新辅助或辅助化疗（例，92%）、辅助内分泌治疗（例，76%）、辅助放疗（例，73%）；

临床分期：0期（3例，2%）、I期（32例，23%）、II期（68例，48%）、III期（39例，27%）；

?治疗与随访信息：

随访：37例患者发生远端复发，复发患者的中位复发时间为32months，从手术到患者死亡或最后一次随访的中位时间7.1years；

采集时间：例患者，术后血（例，78%，采集时间中位值：术后3.53months）、术后一年（例，86%，采集时间中位值：术后14.2months）、术后4年（38例，27%，采集时间中位值：术后54.97months），共采集例血浆样本；

*note：37例发生远端复发患者中，术后血30例、术后一年血32例、术后四年血4例

辅助治疗：47例患者术后接受化疗，20例患者术后一年接受化疗；

?研究结果：

个性化SNV集合：根据名患者的活检样本，针对不同患者，特异性SNV中位数为57个（rang：2-）；

*note：每例患者的特异性SNV数远低于基准测试（标准品测试）中的个SNV。

术后MRD-positive可高度预测患者的远端复发。

HR风险比=5.1；

在研究样本中发现3例术后MRD阳性，但随访未复发的患者：其中2例患者采血时正在接受辅助治疗，另一名患者为术后7天采血，由于全身辅助治疗会降低乳腺癌复发的风险，在随后的血浆样本中，这3例患者均为MRD阴性；

高灵敏度ctDNA检测法的远端复发PPV=70%（7/10）；

临床特异性=96%（78/81）；

NPA=77%（78/）；

临床灵敏性=23%（7/30）；

6例局部复发患者为MRD阴性；

?研究结果：

治疗后患者的MRD状态可更好地预测远端复发

术后1年，6例复发患者均检出MRD-positive，中位时间21.7months；

HR风险比=20.8

Y1样本的PPV=%（6/6）；

临床特异性=%（90/90）；

NPV=78%（90/）；

临床灵敏性=19%（6/32）；

术后4年：共有38名患者接受采样

38例患者中，只有3例患者复发（非乳腺癌复发）：其中1例患者在临床转移确诊前18.9个月，检测显示MRD阳性，其余两例未达到检出限（0.和0.）；

结果4:影响MRD检测的临床灵敏度的因素

?研究结果：

采样时间与复发时间之间的时间差会影响MRD检测

MRD-positive患者从最后一次采血检测到复发，中间的时间间隔为11.5months；

MRD-negative患者从最后一次采血检测到复发，中间的时间间隔为23.8months。

技术灵敏度是由纳入跟踪的突变数目决定的

分析突变数目越多，其MRD最佳检测限就越低，其临床灵敏度最高；

例无远端复发患者中，追踪更多突变与MRD的检出无相关性（P=0.）

若每个患者中追踪的突变较少，则有36%（5/14）的样本检不出MRD

MRD-positive患者中，比临床诊断提前18.9months预警复发

研究结论

?追踪cfDNA中的大量个体化肿瘤突变可提高MRD的检测效率，但其灵敏度取决于可追踪的肿瘤突变数量

该检测技术在标准品实验中，追踪个SNV，其灵敏度比ddPCR高倍；

临床样本中，通过活检组织的WES测序分析，可选定的SNV数目中位值=57，远小于；

该检测技术在新诊断的MBC患者中，临床灵敏度为81%（n=13/16）；术后血23%（n=7/30）；术后1年时的临床灵敏度为19%（n=6/32）；

术后1年时MRD检测与远端复发密切相关[HR=0.8；95%可信区间，7.3–58.9]。从第一个阳性样本到复发的中位提前期为18.9个月。

讨论

优势和意义：

1、本研究开发和验证了一种基于血液ctDNA的MRD检测技术，依托追踪多个特异性突变提高检测灵敏度

特异性的SNV位点来自于患者的活检组织检出突变，根据主克隆/亚克隆排序，选定血浆检测的SNV集合；

选定的SNV越多，越有利于提高检测灵敏度；

将该检测法应用到经过治疗的乳腺癌患者中，可在患者出现转移性复发钱检测到MRD；

2、量化了检测限和tumorfraction

检测限的确定可以清楚地了解某个特定的检测是由于检测性能或缺乏MRD而结果呈阴性；

3、本研究对患者进行了长达13年的随访，这对于复发或转移患者，尤其是HR+/HER2+患者尤其重要。同时，该检测技术可以比临床诊断提前18.9个月检出MRD，为MRD-positive患者在发展为转移疾病前提供治疗机会。

局限性：

1、该研究中对患者采样频率相对较低，并集中在有治疗决策的关键节点，而大部分患者完成辅助治疗后只有术后血、术后1年的采样节点，当尽限于术后第一个采样节点时，该技术的临床灵敏度为23%；

2、由于存在多个影响因素，例如患者群体、治疗方案、采样时间及随访时间的差异等，对于研究中比较临床灵敏度和提前期是一项具有挑战性的工作；

3、本研究中大多数患者是通过WES对活检组织进行测序分析，鉴定出的突变较少，未能发挥大集合突变指纹谱的优势；基准测试结果表明，panel可达到20ngDNA到1/k稀释比的可靠检出，与ddPCR的1/1k相比，该检测技术的检测限在1/1k-1/10k间，而增加追踪SNV位点数目，可提高临床灵敏度；未来可采用WGS对活检组织进行测序，求得更广泛的突变指纹谱；

4、本研究的队列人群为常见乳腺癌亚型，缺乏各亚型中MRD检测的探究；

5、部分外周血样本保存时间较长，处理后血浆体积很小，导致GEs较少。

关于吉因加

_

吉因加创立于年，是国内创新型肿瘤精准医疗高科技企业。公司立足国产NGS平台和肿瘤基因大数据，布局肿瘤防治全链条，打造临床检测、医疗器械制造、科技合作、肿瘤防治四大业务板块，致力于成为最值得信赖的肿瘤基因大数据服务平台。

基于国产NGS战略，吉因加自主品牌的Gene+Seq-/0基因测序仪、人EGFR/KRAS/ALK基因突变检测试剂盒以及Gene+OncoBox肿瘤NGS全自动分析解读一体机配套软件分别获得国家药品监督管理局（NMPA）三类和二类注册证，以“三证齐全”的优势为肿瘤NGS入院提供一体化解决方案。

吉因加位于北京、苏州和深圳的医学检验实验室均获得当地卫健委颁发的医疗机构执业许可，是按照国际高标准建立的临床NGS基因检测实验室。北京吉因加医学检验实验室连续五年在卫健委临检中心（NCCL）、美国病理学家协会（CAP）、欧洲分子基因诊断质量联盟（EMQN）等国内外权威机构的室间质评和能力验证项目中表现优异，并获得CAP证书。

吉因加坚持基因大数据驱动肿瘤防治一体化和诊疗一体化，结构化存储肿瘤数据19万多份，与国内外医院、药企及科研机构开展临床科研合作，发表SCI论文篇，影响因子1分，以大数据持续赋能产品服务的升级迭代和临床价值挖掘，打造从临床检测、科研服务到药企服务、肿瘤早期检测等肿瘤精准医疗上下游的产业闭环。

预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇