乳腺癌转移频发,如何利用单细胞技术进行伴

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循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell，CTC）是指从恶性肿瘤原发部位脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环的细胞。

CTC在患者外周血中数量极为稀少，一般~个白细胞中仅含有1个。与传统的肿瘤标记CA-，及影像检测B超、磁共振、PET-CT相比，CTCs检测有更高的重复性和敏感度。

通过对CTCs连续的检测可以及早评估治疗效果，据此及时转变为更有效的治疗方案，提高存活率。随着对CTC认识的拓展，其应用已经从数目走向了分子分型和细胞测序时代。

由华盛顿大学医学院血液肿瘤学教授、癌症创新中心主任CAnthonyBlau团队发表在JNatlComprCancNetw上的结果表明，CTCs是评估乳腺癌转移治疗的一个灵敏和动态的指标，以CTCs为基础进行的癌症组学强化试验，获得了患者在癌症发展进程中各个时间点的组学信息，并通过分布式网络集合多个研究人员的专业知识对患者的治疗方案与临床试验药物进行选择，以提高患者的生存率。

案例介绍

一名56岁的转移性三阴性乳腺癌患者。在年夏天，注意到右乳房有一个肿块。先后分别接受了腋窝淋巴结清扫术，6个周期的多西他赛（docetaxel），阿霉素（doxorubicin）和环磷酰胺（cyclophosphamide）治疗，放疗，双侧卵巢切除术和阿那曲唑（anastrozole）。

年夏天的例行随访发现，CA15-3升高（U/mL，正常范围30U/mL），血小板计数低（84,/mcL，正常,/mcL）。影像学检查显示脊柱，骨盆和骨的病变与转移性疾病一致。为了确认肿瘤生物标志物状态的明显变化，随后进行了2次骨髓检查，均证实了ER-/PR-/HER2-乳腺癌细胞的广泛浸润。之后开始接受顺铂治疗。

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对顺铂治疗的反应

骨转移乳腺癌对顺铂的反应评估具有挑战性。但是，CTCs可以提供治疗反应的灵敏和动态标记。首次使用顺铂7天后，CTC增加了近4倍（图A），而CTCfragments（CD45-/EpCAM+/CK+）增加了倍以上（图B）。

（实心箭头表示每周进行顺铂治疗；空心箭头表示每3周进行一次顺铂治疗；L表示白细胞去除术；空心矩形表示克唑替尼治疗；对号表示依瑞布林治疗。C，D，E图相同）

此后，CTC和CTCfragments均显着下降（分别倍和3,倍），这反映为癌症抗原（CA15-3）水平的逐渐下降（图D）和血小板计数的正常化（图E）。这些结果与顺铂的显著治疗效果、骨髓中肿瘤细胞的杀死和清除以及血小板生成的恢复相一致。

CTCcluster增加了其转移能力，顺铂治疗也与CTCcluster数量的减少有关（图C）。

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罕见的ROS1变异和克唑替尼治疗

ROS1变体上，因为包含ROS13端的致癌融合，一般发生在约2%的非小细胞肺癌中，并且与克唑替尼的敏感性有关。综合考虑后，专家组建议使用克唑替尼或成纤维细胞生长因子受体抑制剂（由于神经病变，该患者在21周后停用了顺铂；图A）。克唑替尼开始使用后，CTC数量急剧增加，同时伴有血小板计数下降和生存状况恶化，该药物在3.5周后停药（图A）。进行第二次白细胞去除术，然后用批准的依瑞布林进行经验性治疗。

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病情后期，CTC广泛存在肺小动脉血管中

患者死亡后，对患者进行尸检，发现血管内广泛存在肿瘤细胞，肺、心外膜和大脑中存在肿瘤组织，并伴有小动脉血管的弥漫性闭塞。同时发现，在死亡的前几天，CTC显著增加。

（在第天CTCcluster的荧光图像，其中绿色表示CK，红色表示EpCAM，蓝色表示DAPI）

实验方法

本研究中，使用CyteFinderII平台对CTC进行药物及治疗的伴随诊断。

该平台为稀有细胞从血液（骨髓、体液、腹水、尿液等）样本到单细胞测序的一体化解决方案，包括稀有细胞（稀有度1:4千万）的富集涂片、多靶点染色、全景扫描、精准分型、单细胞提取等步骤。

专利的产品，保证有核细胞无损失，且无损伤（可用于活细胞研究）；

配套多靶点试剂盒，7通道全景高速扫描；

来源于临床真实数据集成的AI智能识别数据库（+参数，5,+临床病例）；

物理机械式的单细胞提取，不影响细胞活性，满足下游各种组学分析。

抗原特异性T细胞

免疫系统可以为机体提供针对病原体和恶性肿瘤的抗原特异性保护，但两者都发展出了逃避免疫监视和遏制的策略。有限的免疫反应通常取决于稀有的抗原特异性T细胞亚型的激活。RareCyte平台提供了集成的多靶点成像和单细胞提取功能，可以对抗原特异性T细胞做表型鉴定和分离，以进行基因组、转录组、蛋白组等多组学分析，从而研究宿主防御的复杂性。

验证T细胞特异性的实验设计

CD8纯化T细胞标记与激活肽或对照肽孵育。用激活抗原特异性的四聚体以及混合物对细胞进行染色，确认细胞活力并鉴别CD8+T细胞。提取出CD8+T细胞，做转录组扩增和RNA-seq，进行差异表达和TCR序列分析。

流感四聚体染色T细胞的多靶点成像

未刺激（对照肽）和刺激（流感肽）群体中鉴定出的流感四聚体阳性T细胞的代表性图像。鉴定出的T细胞显示出CD3和CD8的标记染色。

四聚体染色的CD8+T细胞的RNA-seq分析

提取的四聚体阳性的T细胞进行RNA测序：

DESeq2和分层聚类分析揭示了个基因的差异表达；

A图中前50个差异表达的基因的蛋白质STRING分析表明：TCR信号转导/炎症反应和细胞因子信号转导/核糖体合成通路参与活T细胞的生理作用，进一步验证该方法的特异性。

图文来源：普华量宇

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