多重荧光免疫组化技术助力肿瘤研究

背景

肿瘤免疫治疗作为继手术、放疗、化疗、靶向治疗后癌症的一种有效治疗手段，其作用原理依赖于肿瘤免疫微环境中的免疫细胞以及相关的免疫检查点蛋白，所以对肿瘤免疫微环境中相关生物标志物以及免疫检查点的高通量分析和临床验证在肿瘤免疫治疗的预测以及疗效评估中具有重要的意义。

肿瘤免疫微环境中免疫细胞的活化或抑制状态、免疫细胞的密度以及肿瘤细胞与免疫细胞之间的空间位置等都将对免疫治疗的应答评估产生重要影响。

因此，对肿瘤免疫微环境中的诸多信息进行分析，既能够帮助我们预测治疗策略的有效性也能够助力发现潜在的生物标志物或免疫细胞亚型来优化免疫治疗评估系统，提供更加准确的预测或用药指导。

多重免疫荧光组化技术的优势

常规的免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）是组织病理学领域常用的诊断技术，但随着对免疫治疗中生物标志物和肿瘤免疫微环境的深入研究，其应用具有一定的局限性，而mIHC可以对肿瘤免疫微环境进行高维分析。

总之，与传统的免疫组化相比，mIHC具有多重、荧光、定量性、数据量大、信息丰富等突出优势。

mIHC在肿瘤领域中的应用

随着多重免疫荧光技术的快速发展，其广泛应用于肿瘤领域的相关研究。

以下为mIHC技术在肿瘤领域的相关应用场景和描述。

此外，病理图像分析软件也被快速开发，它可以自动识别和定量分析生物标志物的表达水平和空间分布，帮助我们更好地理解肿瘤的发展和进展。更好地解决多重免疫荧光表型分析的难点。

肿瘤免疫微环境分析

Badr使用5色的多重免疫荧光组合(包括CD68、CD4、CD8、CD20和FOXP3)对93例治疗初期的炎症性乳腺癌样本进行免疫微环境分析，并使用病理图像分析软件分析其免疫表型[2]。发现CD20+、CD8+、CD4+和FOXP3+细胞的共浸润以及CD68+与FOXP3+细胞的共存与更好的治疗效果相关，而耐药肿瘤的特征则是CD4+、CD8+、FOXP3+和CD68+细胞的共浸润以及CD68+和CD20+细胞的共表达（图2）。

图1.炎症性乳腺癌的代表性多重免疫荧光图像及免疫细胞表型

使用mIHC技术对免疫微环境进行分析，可以更好了解患者经治疗后组织的免疫景观和免疫治疗的潜力。

生物标志物开发

利用mIHC技术，检测结肠直肠癌组织和癌旁正常组织中的三种肿瘤相关抗原，包括HER2、CD、PD-L1和CD68[3]。结果发现，与正常组织相比，四种标记物在癌组织中均上调。并且CD、HER2、PD-LI和CD68的表达分别与病理分级、T分期、肿瘤大小、转移相关，它们可作为CRC患者的诊断和预后生物标志物（图3）。

图2.结直肠癌的代表性mIHC图像

微环境中不同类型细胞间的空间分布关系

研究者在对胰腺导管腺癌组织进行多重免疫荧光染色后，使用HALO软件的空间分析模块分析PD-1+或PD-1-CD8+T细胞与PD-L1+或PD-L1-CD68+巨噬细胞的邻近关系[4]。空间分析结果显示，PD-L1+CD68+肿瘤相关巨噬细胞的丰度与PD-1+CD8+T细胞浸润之间存在相关性，表明肿瘤免疫与预后不良相关（图4）。

图3.胰腺导管腺癌组织的代表性mIHC图及细胞空间分布图

肿瘤组织免疫细胞浸润评估

mIHC可以同时检测肿瘤微环境中不同类型免疫细胞，并评估它们在肿瘤组织中的浸润情况，有助于判断治疗前后肿瘤的免疫反应状态。为了确定治疗前肿瘤内部和周围的T细胞特征，Church使用了多重免疫组织化学对组织样本进行染色[5]。虽然肿瘤中没有明显的免疫细胞浸润，但瘤周和间质区域有丰富的CD3+、CD8+和PD-L1+细胞，表明T细胞表型为“排斥型”。此外，还确定了肿瘤边缘CD4+T细胞的特征，CD4+/T-bet+细胞较多，而CD4+/FoxP3+细胞较少（图5）。

图4.原发肿瘤组织代表性多重免疫荧光图像及定量分析

因此，mIHC可以检测肿瘤微环境中免疫细胞的亚型和浸润情况，以便于进一步评估肿瘤免疫治疗方案的效果和可行性。

肿瘤免疫治疗相关机制研究

mIHC可以检测免疫相关标记物的表达水平和定位，帮助研究者发现肿瘤治疗中的相关作用靶点和机制。研究人员以黑色素瘤作为研究对象，研究PD-1/CTLA-4免疫治疗黑色素瘤诱发肠炎副反应的分子机制[6]。借助mIHC对诱发肠道炎性反应病人的组织切片进行分析，发现免疫治疗激活组织驻留免疫细胞的活化是肠炎副反应的诱因（图6），通过抑制相应细胞因子、趋化因子或表面受体的功能能够有效改善免疫治疗诱发的肠道炎症副作用。

图5.CPI+结肠炎患者和对照组患者的多重免疫荧光图像

大橡科技多重免疫组化检测平台

多重免疫组化可以在一例类器官、组织样本上实现大于3种以上的分子标记，将多元信息呈现在同一画面内，配合工具进行定量分析，能够对类器官、组织微环境中目标分子或细胞及其相关因子进行全面分析。大橡科技提供定制型Panel染色和常规免疫分析Panel染色服务以及相关分析。

定制型Panel服务：

多靶点技术染色+全切片/光谱成像+标准数据分析。

标准数据分析：

分别划分肿瘤和间质区域；每个区域中的每个指标可输出三种数据：

①阳性细胞个数（n/视野）

②阳性细胞百分比（%/视野）

③阳性细胞密度（n/mm2）；

单个指标还可输出阳性强度，评分依照信号强度分为四级评定。不同区域内10个以内marker组合定量统计（每个组合marker数量不限，阴阳不限）。

此外，大橡科技也可以提供包括细胞分型、定量和空间近邻分析等高阶数据分析。

常规免疫分析Panel：

提供多种免疫检测Panel，以便于客户针对肿瘤类器官/组织进行肿瘤免疫微环境评估以及IO药物的开发与转化。适用于肺癌（NSCLC/SCLC）、结直肠癌（CRC）、三阴性乳腺癌（TNBC）、胃癌（GC）、食管癌（EC）、鼻咽癌（NPC）、宫颈癌（CC）和肝癌（HCC）等其它癌种。检测周期：两周。

结论

mIHC/mIF技术在肿瘤免疫治疗中的角色逐渐突出，可以帮助评估肿瘤免疫微环境、研究免疫治疗机制、评估免疫治疗的效果等，其同时检测多种分子的优势，能够快速、准确地获得多种分子的定位和定量信息，为肿瘤免疫治疗提供了更为准确和全面的分析方法。未来，随着技术的不断改进和优化，多重免疫荧光技术将在肿瘤免疫治疗中发挥更大的作用。